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蛋白质免疫印迹(Western Blot,即 WB)实验样品与运输要求
发布日期:2020-10-14
浏览次数:12689

关于蛋白质免疫印迹(Western Blot,即 WB),想必做蛋白实验的小伙伴们都不会陌生,作为免疫学中最常用的一种实验方法,其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析条带大小和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。Western Blot 服务样品收集及运输要求有哪些注意事项呢?

WB服务样品与运输要求

细胞样品:需要用PBS 清洗后,离心收集细胞沉淀,不能残留PBS,封口膜封口,标记,放入-80°C 冰箱保存,用干冰运输。

组织样品:客户取样品后,尽量快速操作,放入液氮中速冻或者立刻存入-80°C 冰箱,样品不能反复冻融。干冰运输。

蛋白样品:未变性的蛋白需要存入-80,用干冰运输;Loading Buffer 煮沸的蛋白,需要提供蛋白浓度(浓度需在2ug/ul 以上),用冰袋运输。

:1)具体的样品数量,根据客户实验请随时沟通;

2)把样本放入自封袋或样品盒中,备注:姓名,日期,样品数等样本信息,低温运输。

样品需要客户自留,实验样品不返还。

样品的收集与保存

悬浮细胞

将细胞和培养液一起收集到15ml 离心管中,低速离心收集(1500rpm,离心5min),加入PBS 轻轻吹打细胞,重复两次,转入1.5ml 或者2ml 离心管中,低速离心沉淀细胞,弃去PBS(需要细胞沉淀,不能残留PBS);做好标记,每个样本管用封口膜封口,立即保存于-70℃冰箱中(短时间保存)。

贴壁细胞

(1)胰酶消化收集细胞:用胰酶消化后(注意消化时间,防止消化过度对细胞造成损伤),收集到15ml 离心管中,低速离心(1500rpm,离心5min),弃去上清;加入PBS 轻轻吹打细胞,重复两次,转入1.5ml 或者2ml 离心管中,低速离心沉淀细胞,弃去PBS;做好标记,每个样本管用封口膜封口,立即保存于-70℃冰箱中(短时间保存)。

(2)细胞刮子收集细胞:对于某些蛋白(对胰酶比较敏感的蛋白或者实验特殊要求,如膜蛋白提取,不能用胰酶消化),预留一些培养液,直接用细胞刮子刮下细胞(避免来回反复刮细胞,以减少对细胞的损伤);收集到离心管中,低速离心(1500rpm,离心5min),弃去上清;加入PBS 轻轻吹打细胞,重复两次,转入1.5ml 或者2ml 离心管中,低速离心沉淀细胞,弃去PBS;做好标记,每个样本管用封口膜封口,立即保存于-70℃冰箱中(短时间保存)。

组织样本

组织样本离开生物体后,应尽快操作-特别是肠道、胰腺含酶量丰富的样本,(5 分之内,冻存管应先做好标记),用预冷的PBS 或者生理盐水清洗,尽量除去残留血液,用滤纸把多余PBS 吸取干净;以合适大小(50-100mg,约半个或一个黄豆粒大小,也可根据实验要求进行调整)进行分装,做好标记,立刻将样本放入液氮中速冻后立刻转入-70℃冰箱中或一直于液氮中保存,避免反复冻融。

补充说明

每一份样本除去做实验外,请自己多预留几份进行备份。

(1)总蛋白:需要大于106 个细胞,正常可以检测3 个指标左右,如果检测指标较多,根据实验情况准备细胞数。组织样本不少于30mg,若有特殊组织(如骨骼肌、肌肉或结缔组织等),请根据实验情况多准备样本。

(2)膜蛋白:需要细胞量不少于107 个细胞,组织样本不少于30mg;如果样本是贴壁细胞,不能用胰酶消化收集细胞,可以采用细胞刮子收集细胞。

(3)胞核蛋白:冻存的组织和细胞可能会导致胞核蛋白减少,样本要新鲜,不可用长期保存的样本。

(4)检测磷酸化蛋白:长期保存的样本容易使磷酸化蛋白去磷酸化,而导致WB检测不到磷酸化条带,样本要新鲜,样本保存在一个月内使用。

(5)细胞量:不同的细胞系形态不同,细胞生长密度也不同,请根据实际经验确定培养容器和个数(以hela 细胞为例,两个10cm 的培养皿长满能达到1-2*107个细胞),为了达到所需要的细胞量,可以在平时的传代培养时进行细胞计数,以确定培养容器的个数。

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