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【干货】有关细胞侵袭及迁移实验常见问题解答
发布日期:2020-10-10
浏览次数:2677

一、细胞不转移 

分析:“诱惑”不够,很可能是上室混有高浓度血清或者是小室孔径不对。

二、转移过多或过少

分析:预实验结果不准确,细胞状态不佳或细胞接种时计数有误差,所以细胞状态不佳时不建议进行实验,计数前细胞要重新混匀,如果多次正式实验和预实验差距较大则需要重新进行预实验确定接种密度及转移时间。

三、染色后细胞分布不均一

分析:

1.小室未平衡放置于孔板中;

2.细胞悬液加入时局部过多;

3.小室有倾斜或晃动;

4.小室本身渗透膜不平。

解决方法:

1.小室需确认放平于孔板中;

2.细胞悬液要混匀,并且建议滴加;

3.在整个实验过程中小室勿倾斜晃动;

4.多次实验结果中细胞均成环状聚集,需考虑该批次小室是否有问题。

四、复孔间差距较大

分析:计数不准确或加入多个小室时细胞沉降,所以每加一个小室后建议重新混匀。

五、拍照时局部图片对焦不清,背景有染剂

分析:擦拭小室时太用力导致小室局部变形,进而导致拍照时局部对焦不清,另外如果擦拭不干净背景就会有染剂,所以擦拭小室时需掌握好力道,多擦拭几遍。

六、迁移/侵袭实验中细胞未能迁移至基底室

1.选择的膜孔径偏小。确保选择合适孔径的膜,可以尝试更大孔径的膜。

2.ECM铺得太多。过多的ECM可能会堵住孔,尝试使用少量ECM或者其它种类的ECM。

3.气泡聚集。小室下面的气泡会妨碍细胞迁移,导致局部无细胞迁移。可以先放入小室,再先加培养基,避免气泡产生。

4.对细胞没有进行饥饿处理,以及需要设置上下室培养基的FBS浓度梯度。

5.对细胞的刺激没有促迁移作用。确保采用适合该细胞迁移的刺激以及正确的浓度。设置阴性和阳性对照组。

6.细胞传代次数太多。随着衰老和代数增加,细胞形态会发生一些变化。复苏代数靠前的细胞重新开始实验。

7.实验所用的细胞系不正确。确保使用正确的细胞系以及正确的刺激浓度。设置阴性和阳性对照组。

七、迁移/侵袭实验中,对照组和测试组之间没有差别

分析:细胞传代过多。复苏代数靠前的细胞,重新开始实验。

1.移去培养基的顺序有误(基底室和上室)。使用合适的对照,检查添加/替换的顺序是否会影响实验结果。

2.使用的膜孔径大小不合适,太大或太小都会导致细胞很容易迁过去或者很难迁移。

3.小室膜的上层擦拭不充分。一些实验只需要观察基底面的细胞,但是两面的细胞会被染上色并检测到,所以要擦去上层。

八、显微镜下观察不到细胞膜的类型不适合显微镜观察。不是所有膜的材质或孔径大小都适合于显微镜观察。查看说明书以找到推荐合适的膜。悬挂式只有1uM是透明的;站立式只有PTFE膜透明。

九、迁移/侵袭实验中,染色后的结果较难分辨是否为迁过去的细胞

1.背景太脏。使用干净的试剂,操作过程中不要带入杂质,确保背景干净,不会干扰显微镜观察。

2.Millicell小室是多孔径滤膜,染色后显微镜下会看到很多被染上色的圆孔,这是膜的微孔,不是细胞,只有具有明显拉长、扩张等迁移状态的染色才是细胞。

3.培养时间过短。如果很多细胞只染到核,没有拉伸的细胞形态,则提示迁移的时间可能不够,需要延长时间。

十、细胞贴壁不好

1.实验所用的细胞可能需要不同的培养基或者添加物。根据ATCC建议,再次确认细胞所需要的培养基成分和所需添加物。

2.细胞可能需要ECM。种细胞前,铺一层合适的ECM。

3.细胞可能需要另一种ECM。如果细胞贴壁需要ECM,确保使用 的ECM是最合适的,而且浓度正确。

4.起始细胞密度不正确,尝试增大或者降低起始细胞密度。

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