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蛋白免疫应印迹

蛋白免疫应印迹Western Blot)采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质混合物,经过SDS-PAGE分离的蛋白质被到转移到固相支撑物(NC膜,PVDF膜等)上后,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变,以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与其对应的抗体发生免疫反应,一抗再与酶标记的二抗起反应,经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平。

由于Western blot技术服务具有简便,快捷等特点,所以目前该技术也被广泛应用于蛋白质表达水平的检测。

菲优特检测依托青岛市生物技术药物公共研发平台、经验丰富的科研人员、日趋完善的技术平台,围绕蛋白工程、组学等领域建立了蛋白技术服务体系,致力于为广大科研工作者的研发项目保驾护航,为您提供价格实惠、品质优良、快速高效的技术服务。

蛋白免疫应印迹实验

蛋白免疫应印迹(Western Blot)实验服务项目
蛋白质抽提与定量Western Blot
图片分析Western Blot实验服务报告提交

 Western blot实验步骤 

1、Western blot蛋白质提取:根据实验目的的不同选择不同的裂解液,如RIPA裂解液、NP-40裂解液、SDS裂解液,同时根据蛋白质提取组分的不同选择不同的方法,如提取核蛋白,细胞质蛋白,膜蛋白等。

2、蛋白定量:根据蛋白质的提取条件不同,可采取不同的定量方法,如bradford法、BCA法等。

3、电泳:依据需要检测蛋白的分子量选取分离胶的浓度,分别配置分离胶和积成胶,凝胶凝固后进行蛋白质上样和电泳。

4、转膜:可采取半干法和湿法转移,当采取半干法转膜时需防止短路:从下到上的顺序:滤纸/PVDF膜/凝胶/滤纸/阴极(bio-rad转膜仪)。

5、封闭:5%脱脂奶粉或5% BSA封闭过夜或室温1小时,孵育时间可根据实验需要进行改变。

6、一抗孵育:5%脱脂奶粉稀释一抗到合适的浓度,与膜室温孵育1小时或4度过夜,孵育时间可参考抗体说明书,并加以优化,一抗孵育后TBST洗膜3次,每次5分钟。

7、二抗孵育:5%脱脂奶粉稀释二抗到合适的浓度,与膜室温孵育1小时,TBST洗膜3次,每次5分钟。

8、显影(ECL法):将A、B两种底物按比例稀释混合均匀后滴在膜上,置于压片盒中,迅速盖上胶片,关闭胶盒进行曝光,曝光一定时间后取出胶片,浸入显影液中显影,直到出现清晰的蛋白质条带,清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影,清水冲净晾干,标定Marker,扫描胶片和Western blot 图片分析。

 Western blot实验送检要求 

新鲜或正确保存的组织、细胞或蛋白样品。

组织样品:每份样品约250~500mg,10-15mg/ml;

细胞样品:每份样品约1×106~1×107 细胞数,浓度>1μg/μl;

蛋白样品:裂解样品总蛋白量>500μg/样品,浓度≥2μg/μl。

菲优特检测秉承“科学 · 独立 · 诚信 · 高效”的服务理念,以专业、专注的态度为您提供精确的检测技术和咨询服务。

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