3D细胞培养，又称三维细胞培养，是将细胞培植在一定的细胞外基质中，细胞外基质蛋白充当生长支架，使细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构，其所建立的细胞生长环境则可最大程度模拟体内环境。
目前大多数科研工作者都还在用培养皿或培养瓶养细胞，在这种培养方式下，细胞的生长是平面的、二维的，即2D细胞培养。此培养方法虽应用广泛，但也屡遭诟病，在平面培养中细胞的生长方式、形态、分化、功能等与体内生理条件下存在明显差异。3D细胞培养为细胞提供更加接近体内生存条件的微环境，能够更好地模拟生理状态。从而获得与体内实验更加一致的实验结果。随着一些新的3D细胞培养技术在生物相关性、使用便利性和通量上的改进，3D细胞培养在基础研究和药物发现中的应用越来越广泛。
3D培养中最常用方法是将细胞包封在水凝胶中，水凝胶为交联的天然基质材料的松散支架结构，例如琼脂糖，纤维蛋白，胶原蛋白或具有高含水量的透明质酸。水凝胶支架在液态时包裹细胞，固态时形成交联网络，细胞粘附力强，有良好的水分、养分交换。水凝胶在体外最常用于肿瘤细胞诱导血管生成模型。
水凝胶支架主要有三大优点：
1、产品组成灵活。完全透明的凝胶可以实时观察细胞的动向，不同的凝胶产品组合方式可以构成不同的3D细胞培养环境。
2、操作简单，控制自如。实验者可调节水凝胶的凝胶硬度，同时还可自行添加生物活性分子，该技术对细胞无任何伤害。
3、应用范围广阔。水凝胶技术可用于细胞培养、标记和显微观察等多个方面。细胞可在凝胶内及上面培养、可以进行活细胞的观察，还可对细胞进行原位固定。
不依赖支架的3D细胞培养
贴壁细胞的天然特性就是易于聚集，并在有阻碍其贴附到培养底面时自发形成球体。常见的球体包括胚胎小体、乳腺球、肿瘤球、肝细胞球、神经球等。常见的制备3D细胞球的无支架方法有：超低吸附表面的微孔板、悬滴法、旋转培养和磁力悬浮法。
细胞球内部具有氧气、营养物质、代谢废物的浓度梯度，能够模拟固态组织的多个特性，是研究实体瘤发生和干细胞分化的重要3D生理模型。同时，相比更复杂的3D模型，细胞球可以很方便地通过光学、荧光、共聚焦显微镜或高内涵系统等进行成像分析，同时更容易实现大小均一的大规模细胞球培养，适用于高通量筛选。
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